La luz y todas las ondas pueden doblarse alrededor de las esquinas de los obstáculos que se encuentran a lo largo de su camino. Debido a este fenómeno, llamado difracción, es imposible enfocar la luz en un punto que es más pequeño que la mitad de su longitud de onda.
En otras palabras, la resolución más alta que se puede lograr teóricamente usando un microscopio óptico es de aproximadamente 250 nm, una barrera llamada límite de difracción. Desafortunadamente, esta resolución no es suficiente para observar estructuras celulares finas, como las que se encuentran en las neuronas.
Durante más de un siglo, los microscopistas estuvieron paralizados por esta barrera clásica hasta la invención de la microscopía de fluorescencia de súper resolución. Un enfoque particularmente poderoso se desarrolló a finales de la década de 1990 y acuñó microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED). Esta técnica requiere que la muestra objetivo contenga fluoróforos, que son compuestos que absorben la luz en una longitud de onda y luego la vuelven a emitir en una más larga.
En la versión más simple de la microscopía STED, los fluoróforos se excitan en un punto circular por irradiación con un láser enfocado limitado por difracción. Entonces, una porción donut-formada alrededor del punto se irradia con la luz menos energética que apaga la fluorescencia por el proceso de la emisión estimulada. Por lo tanto, el efecto neto es que solo los fluoróforos en el centro del donut re-emiten fotones, y debido a que esa área se puede hacer arbitrariamente pequeña, esto permite la microscopía de súper resolución.
Las imágenes STED corregidas capturaron los detalles finos de las dendritas neuronales más profundas mucho mejor que las imágenes STED estándar
Aunque la microscopía STED fue un verdadero avance para la observación de la morfología de las neuronas vivas a mayor resolución, todavía hay margen de mejora.
Ahora, en un estudio reciente publicado en Neurophotonics, un equipo de científicos de la Universidad de Burdeos ha desarrollado un método de calibración simple pero efectivo que permite imágenes STED más precisas a profundidades de tejido más altas. Su enfoque se basa en el análisis y corrección de una de las principales fuentes de error sistemático en microscopía STED para muestras biológicas: la aberración esférica del haz de agotamiento.
FLUORÓFOROS Y NANOPARTÍCULAS DE ORO
Cuando se toma una imagen de una muestra de tejido a profundidades superiores a 40 μm, el haz de agotamiento sufre varios tipos de desenfoque y degradación (aberración) y pierde su forma cuidadosamente elaborada, que es esencial para el método STED. La aberración esférica es el mayor infractor y fue el que los investigadores atacaron. Su estrategia era preparar primero una muestra fantasma del tejido cerebral, un proxy gel-basado con un índice de refracción similar a el del cerebro real. Esta muestra fantasma contenía fluoróforos y nanopartículas de oro homogéneamente dispersos, lo que permitió al equipo visualizar y cuantificar claramente cómo la forma del haz de agotamiento se distorsionó a medida que penetraba más profundamente.
Luego, calcularon los ajustes previos necesarios que se deben hacer al haz de agotamiento de acuerdo con la profundidad del tejido para que su forma final coincida más con la ideal. Los ajustes se realizaron utilizando óptica adaptativa, que es una tecnología desarrollada originalmente por astrónomos para mejorar las imágenes telescópicas que sufren de aberraciones causadas por la atmósfera terrestre.
Una vez que la forma del haz de agotamiento había sido calibrada de acuerdo con las pruebas fantasma, los científicos procedieron a obtener imágenes de tejido neural vivo. Compararon los resultados de la microscopia regular de STED, de la microscopia corregida de STED, y de la microscopia del dos-fotón, una técnica que se ajusta específicamente para la proyección de imagen profunda del tejido.
Los resultados fueron bastante convincentes: las imágenes STED corregidas capturaron los detalles finos de las dendritas neuronales más profundas mucho mejor que las imágenes STED estándar.
Teniendo en cuenta que este novedoso proceso de calibración es robusto, fácil de implementar y relativamente barato, podría incorporarse fácilmente a las prácticas de laboratorio estándar para obtener mejores resultados con microscopios STED.