Una nueva tecnología desarrollada en el MIT permite a los científicos etiquetar proteínas en millones de células individuales en tejidos 3D completamente intactos con una velocidad, uniformidad y versatilidad sin precedentes. Utilizando esta tecnología, el equipo pudo etiquetar en detalle cerebros de roedores completos y otras muestras de tejido de gran tamaño en un solo día. En su nuevo estudio publicado en Nature Biotechnology, también demuestran que la capacidad de etiquetar proteínas con anticuerpos a nivel de células individuales en cerebros completos puede revelar información que otros métodos de etiquetado ampliamente utilizados no han revelado.
El análisis de las proteínas que las células producen es un elemento básico de los estudios en biología, neurociencia y campos relacionados, porque las proteínas que una célula está expresando en un momento dado pueden reflejar las funciones que la célula está tratando de realizar o su respuesta a las circunstancias, como una enfermedad o un tratamiento. A pesar de los avances en la microscopía y las tecnologías de etiquetado, que han permitido innumerables descubrimientos, los científicos aún carecen de una forma fiable y práctica de rastrear la expresión de proteínas a nivel de millones de células individuales densamente compactas en tejidos completos e intactos en 3D.
“Investigar las moléculas dentro de las células requiere disociar el tejido en células individuales o cortarlo en secciones delgadas, ya que la luz y los químicos necesarios para el análisis no pueden penetrar profundamente en los tejidos"
“Convencionalmente, investigar las moléculas dentro de las células requiere disociar el tejido en células individuales o cortarlo en secciones delgadas, ya que la luz y los químicos necesarios para el análisis no pueden penetrar profundamente en los tejidos. Nuestro laboratorio desarrolló tecnologías como CLARITY y SHIELD , que permiten la investigación de órganos completos al hacerlos transparentes, pero ahora necesitábamos una forma de etiquetar químicamente órganos completos para obtener conocimientos científicos útiles”, dijo el autor principal del estudio Kwanghun Chung , profesor asociado en el Instituto Picower para el Aprendizaje y la Memoria, los Departamentos de Ingeniería Química y Ciencias Cognitivas y Cerebrales, y el Instituto de Ingeniería Médica y Ciencia del MIT.
“Imagínese marinar un filete grueso simplemente sumergiéndolo en salsa. Las capas externas absorben la marinada rápida e intensamente, mientras que las capas internas permanecen prácticamente intactas a menos que la carne se remoje durante un período prolongado. El mismo principio se aplica al procesamiento químico de los tejidos: si las células dentro de un tejido no se procesan de manera uniforme, no se pueden comparar cuantitativamente. El desafío es aún mayor para el etiquetado de proteínas, ya que las sustancias químicas que utilizamos para ello son cientos de veces más grandes que las que se encuentran en los adobos. Como resultado, estas moléculas pueden tardar semanas en difundirse en órganos intactos, lo que hace que el procesamiento químico uniforme de los tejidos a escala de órganos sea prácticamente imposible y extremadamente lento”, insistió.
El nuevo método, denominado “CuRVE”, representa un avance importante hacia ese objetivo, ya que demuestra un método fundamentalmente nuevo para procesar de manera uniforme tejidos grandes y densos
El nuevo método, denominado “CuRVE”, representa un avance importante (que se ha llevado a cabo durante años) hacia ese objetivo, ya que demuestra un método fundamentalmente nuevo para procesar de manera uniforme tejidos grandes y densos. En el estudio, los investigadores explican cómo superaron las barreras técnicas mediante una implementación de CuRVE denominada “eFLASH” y brindan abundantes demostraciones gráficas de la tecnología, incluido el modo en que generó nuevos conocimientos en neurociencia. “Es un gran avance, especialmente en términos del desempeño real de la tecnología”, dijo el coautor principal Dae Hee Yun, ex estudiante de posgrado del MIT.
UNA QUÍMICA INTELIGENTE
La razón fundamental por la que es difícil etiquetar de manera uniforme muestras de tejido tridimensionales de gran tamaño es que los anticuerpos se infiltran en el tejido muy lentamente, pero se unen rápidamente a las proteínas a las que se dirigen. El efecto práctico de este desajuste de velocidad es que, simplemente sumergiendo un cerebro en un baño de anticuerpos, las proteínas estarán muy bien etiquetadas en el borde exterior del tejido, pero prácticamente ninguno de los anticuerpos encontrará células y proteínas en el interior.
La estrategia consistía en controlar continuamente el ritmo de unión de los anticuerpos y, al mismo tiempo, acelerar la penetración de los mismos en todo el tejido
Para mejorar el etiquetado, el equipo ideó una forma (la esencia conceptual de CuRVE) de resolver el desajuste de velocidad. La estrategia consistía en controlar continuamente el ritmo de unión de los anticuerpos y, al mismo tiempo, acelerar la penetración de los mismos en todo el tejido. Para averiguar cómo podría funcionar esto y optimizar el enfoque, crearon y ejecutaron una sofisticada simulación computacional que les permitió probar diferentes configuraciones y parámetros, incluidas diferentes tasas de unión y densidades y composiciones de tejido.
Luego se propusieron implementar su enfoque en tejidos reales. Su punto de partida fue una tecnología anterior, llamada "SWITCH", en la que el laboratorio de Chung ideó una forma de desactivar temporalmente la unión de los anticuerpos, dejando que los anticuerpos permearan el tejido y luego volviendo a activar la unión. A pesar de lo bien que funcionó, dijo Yun, el equipo se dio cuenta de que podría haber mejoras sustanciales si la velocidad de unión de los anticuerpos pudiera controlarse constantemente, pero los productos químicos utilizados en SWITCH eran demasiado agresivos para un tratamiento tan continuo.
Cabe destacar que cada una de estas muestras se etiquetó en un día, una velocidad “ultrarrápida” para órganos enteros e intactos. Además, las diferentes preparaciones no requirieron nuevos pasos de optimización
Entonces, el equipo examinó una biblioteca de productos químicos similares para encontrar uno que pudiera reducir de manera más sutil y continua la velocidad de unión de los anticuerpos. Descubrieron que el ácido desoxicólico era un candidato ideal. Usando ese producto químico, el equipo no solo podía modular la unión de los anticuerpos variando la concentración del producto químico, sino también variando el pH (o acidez) del baño de etiquetado. Mientras tanto, para acelerar el movimiento de los anticuerpos a través de los tejidos, el equipo utilizó otra tecnología anterior inventada en el laboratorio de Chung: el electrotransporte estocástico, que acelera la dispersión de los anticuerpos a través de los tejidos mediante la aplicación de campos eléctricos.
La implementación de este sistema eFLASH de dispersión acelerada con velocidad de unión continuamente modificable produjo la amplia variedad de éxitos de etiquetado demostrados en el artículo. En total, el equipo informó haber utilizado más de 60 anticuerpos diferentes para etiquetar proteínas en células de cerebros completos de ratones y ratas; embriones completos de ratón; otros órganos completos de ratón, incluidos pulmones y corazón; y bloques de tejido cerebral de animales más grandes, incluidos humanos. Cabe destacar que cada una de estas muestras se etiquetó en un día, una velocidad “ultrarrápida” para órganos enteros e intactos. Además, las diferentes preparaciones no requirieron nuevos pasos de optimización.