La microscopía electrónica criogénica (cryo-EM) ha permitido a los investigadores estudiar cómo se ensambla la maquinaria de replicación del ADN en los sitios donde está dañado.
El ADN celular está continuamente expuesto a agentes que lo dañan tanto endógenos como exógenos, como especies reactivas de oxígeno y radiación ultravioleta.
Para reducir las consecuencias biológicas del daño del ADN, todos los organismos vivos han desarrollado mecanismos para tolerar y reparar el daño del ADN para tratar de garantizar que la información genética se herede con precisión. Uno de esos mecanismos, llamado síntesis de translesión (TLS), permite que la replicación del ADN proceda a través de lesiones de ADN no reparadas.
TLS implica enzimas de síntesis de ADN de alta precisión (ADN polimerasas replicativas) que se reemplazan temporalmente con polimerasas TLS especializadas de baja fidelidad que pueden garantizar la supervivencia celular a expensas de la introducción de mutaciones.
La actividad mutagénica y sintética de translesión de las polimerasas TLS puede hacer que las células normales se vuelvan cancerosas o que las células cancerosas se vuelvan resistentes a los medicamentos. La polimerasa Pol TLS de la familia Y es capaz de realizar la síntesis de ADN a través de varias bases dañadas y se recluta en las lesiones de ADN mediante la proliferación del antígeno nuclear celular (PCNA).
Han estado usando crio-EM para investigar la estructura tridimensional y la función de los complejos de proteínas clave involucrados en la replicación y reparación del ADN
Estudios anteriores han demostrado que el PCNA está regulado por ubiquitinación. "La adición de una sola molécula de ubiquitina en el residuo de lisina 164 (K164) de PCNA facilita el reclutamiento y retención de TLS polimerasas en los sitios de daño, pero la base estructural de la interacción entre estas polimerasas y el PCNA ubiquitinado es poco conocida", han señalado los investigadores.
El grupo de científicos ha estado colaborando con el laboratorio dirigido por Samir Hamdan, un experto en análisis de una sola molécula de la replicación del ADN humano, desde 2018. Han estado usando crio-EM para investigar la estructura tridimensional y la función de los complejos de proteínas clave involucrados en la replicación y reparación del ADN.
Su último estudio describe reconstrucciones crio-EM de Pol humano de longitud completa unida al ADN, un nucleótido entrante y PCNA sin modificar o PCNA monoubiquitilado, con una resolución casi atómica.
Descubrieron que, en ausencia de ADN, la estructura de Pol unida al PCNA es muy flexible, lo que sugiere que se requiere la unión al ADN para formar un complejo rígido y activo.
“Nuestros datos proporcionan un marco estructural para explicar cómo PCNA recluta una polimerasa TLS de la familia Y en los sitios de daño del ADN. Al comprender las interacciones entre las proteínas que forman estos complejos y cómo se regulan, podemos identificar formas de reducir o aumentar su función para aplicaciones médicas”, han concluido.